實(shí)驗(yàn)室常用的離心方法

發(fā)布時(shí)間：

2014-03-17

概要：

(1)差速離心法(又稱分步離心法) 采用不同的離心速度和離心時(shí)間,使沉降速度不同的顆粒分步離心的方法,稱為差速離心。操作時(shí),將含有兩種不同顆粒的混懸液,以常速離心，使大的顆粒下沉，將上清液傾倒于另一離心管中，再加大離心力，離心一定時(shí)間，分離小的顆粒，反復(fù)多次分離，達(dá)到分離目的。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子；分離時(shí)間短、重復(fù)性高；樣品處理量大。缺點(diǎn)是：分辨率有限、分離效果差，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，不能一次得到純顆粒；壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；顆粒被擠壓，離心力過大、離心時(shí)間過長會使顆粒變形、聚集而失活。

圖-1 差速離心法原理示意圖

(2)密度梯度離心法(又稱區(qū)帶離心法) 該法又分為速率區(qū)帶離心法和等密度區(qū)帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是：具有很好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適用范圍廣，既能分離沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會積壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺點(diǎn)是：離心時(shí)間較長；需要制備梯度液；操作嚴(yán)格，不宜掌握。
①速率區(qū)帶離心法：是根據(jù)分離的粒子在離心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)形成幾條分開的樣品區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。臨床常使用的分離液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個(gè)核細(xì)胞分離出來，前一種分離液將血液中單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）分為一個(gè)層，同時(shí)提出。而Percoll分離液將血中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分為二個(gè)梯度層，分別提取。后者分離效果優(yōu)于前者，但操作繁瑣。

圖-2 速率區(qū)帶離心示意圖

②等密度區(qū)帶離心法：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶，稱為等密度區(qū)帶離心法。等密度區(qū)帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無關(guān)，但后兩者決定著達(dá)到平衡的速率、時(shí)間和區(qū)帶的寬度。

圖-3 等密度區(qū)帶離心示意圖

（3)分析性超速離心法
①分析型超速離心機(jī)的工作原理：分析型超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個(gè)柔性的軸連接成一個(gè)高速的驅(qū)動裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納兩個(gè)小室：分析室和配衡室。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普通水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下兩個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質(zhì)和DNA）或折射率的不同對沉降物進(jìn)行監(jiān)測。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。

圖-4 分析型超速離心系統(tǒng)示意圖

②分析性超速離心法的應(yīng)用范圍：測定生物大分子的相對分子重量。測定相對分子重量中應(yīng)用最廣的是沉降速度法，用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。生物大分子的純度估計(jì)。分析型超速離心機(jī)已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。分析生物大分子中的構(gòu)象變化?？梢酝ㄟ^檢查樣品在沉降速度上的差異來證實(shí)。

關(guān)鍵詞：

離心機(jī)的分類與結(jié)構(gòu)

離心力與相對離心力