土壤離心機(jī)提取土壤DNA的方法

發(fā)布時(shí)間：

2015-03-11

概要：

在這步加上PBS洗滌下土壤，一是能夠去除些雜質(zhì)，二是能夠使得土壤處于懸浮狀態(tài)，然后可以在渦旋儀上劇烈渦旋2－3min，使得土壤顆粒破碎。然后用土壤離心機(jī)12000rpm離心5min，棄上清。

1.稱取樣品土樣5g,加入滅菌的石英砂，不要液氮研磨，這樣子對(duì)DNA傷害很大，幾乎全部片段化了?？梢栽谶@步加上PBS洗滌下土壤，一是能夠去除些雜質(zhì)，二是能夠使得土壤處于懸浮狀態(tài)，然后可以在渦旋儀上劇烈渦旋2－3min，使得土壤顆粒破碎。然后用土壤離心機(jī)12000rpm離心5min，棄上清。

2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm搖2h；

3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,間隔15min顛倒搖勻數(shù)次；

4.6000rpm室溫離心15min,收集中間液相層；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上離心，收集中間液相層，合并；重復(fù)一次；這里可以考慮再增加抽提一次?；蛘哂?mL而不是3mL。最后實(shí)在裝不下了可以分在兩個(gè)50mL離心管里面離心。

5.向收集的液相層中加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm離心10min，收集上部液相層；在做抽提的時(shí)候加用一步酚氯仿，原因是酚能夠更好的使蛋白變性。如果不考慮用酚的話，建議用氯仿異戊醇抽提兩次。會(huì)發(fā)現(xiàn)顏色會(huì)變清不少。

6.第5步收集液相層中加入0.1倍體積的乙酸鈉，0.6倍體積的異丙醇，室溫放置1－2h；

7.沉淀物12000rpm離心15min，棄上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗滌，12000rpm離心5min，棄上清；12000rpm離心30sec，移液槍析出殘留液體；

8.室溫自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。沉淀貼壁很緊，不要用小槍頭吹吸攪動(dòng)，可以將沉淀浸沒后放置于4度過夜或數(shù)小時(shí)，沉淀就會(huì)蓬松。

土樣比較特殊，黑色，腐殖質(zhì)等物質(zhì)含量高，這個(gè)必須純化，樣品里面太多的多糖類物質(zhì)和腐殖質(zhì),選擇qiagen的40KB的膠回收試劑盒，嫌太貴的話可以考慮電洗脫。

   DNA提取液組成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0

   以上為三次提取的詳細(xì)過程及試劑用量。

注意事項(xiàng)，所有的槍尖，包括1mL的都要去尖后滅菌。每個(gè)步驟動(dòng)作都要輕柔，這樣DNA才會(huì)完整。

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